Autodisplay komplexer Enzyme für biokatalytische Anwendungen

Eva Kranen

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Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden eine homodimere Prenyltransferase aus Aspergillus fumigatus und eine homotetramere NADH-...

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Beschreibung

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden eine homodimere Prenyltransferase aus Aspergillus fumigatus und eine homotetramere NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis mittels Autodisplay an die Oberflche von Escherichia coli gebracht. Diese beiden Enzyme knnen als komplexe Enzyme bezeichnet werden, da sie aus zwei bzw. vier Untereinheiten bestehen und im Fall der NADH-Oxidase (NOx) einen FAD-Cofaktor pro Untereinheit enthalten. Dieser muss in das Enzym inkorporiert werden, damit dieses oxidative Aktivitt zeigen kann. Die Oberflchenstndigkeit beider Enzyme konnte durch einen Zugnglichkeitstest fr extern zugegebene Proteasen belegt werden. Nach Anzucht in LB-Medium zeigte der NOx-Ganzzellbiokatalysator eine Aktivitt von 5,54 mU/mL bei Einsatz einer optischen Dichte bei 578 nm (OD578) von 1. Wurde der NOx Ganzzellbiokatalysator in M9-Minimalmedium kultiviert, konnte die Aktivitt auf 16,38 mU/mL bei einer OD578 von 1 gesteigert werden. Der NOx-Ganzzellbiokatalysator war in Zellsuspensionen mit einer OD578 von 10 bei 20 C und 70 C ohne Verlust an Aktivitt und ohne Verlust der Zellintegritt sieben Wochen lagerfhig. Bei Untersuchung der Wiederverwendbarkeit in fnf wiederholten Reaktionszyklen lie sich am Ende des fnften Zyklus unter den gewhlten Bedingungen noch eine NADH Oxidase-Aktivitt von 50 % verglichen mit dem ersten Zyklus detektieren. In einem kombinierten Einsatz mit einer Acetaldehyd-Dehydrogenase konnte der NOx Ganzzellbiokatalysator erfolgreich zur Regeneration des oxidierten Pyridinnukleotid Cofaktors NAD+ eingesetzt werden.  Die Prenyltransferase FgaPT2 zeigt ein sehr breites Substratspektrum und akzeptiert neben dem originren Substrat Tryptophan auch 17 weitere Indolderivate. Die Aktivitt des FgaPT2 Ganzzellbiokatalysators wurde durch die erfolgreiche Prenylierung der Substrate Indol-3-propionsure und L-?-Homotryptophan belegt, von denen jeweils 1 mM eingesetzt worden war. Dabei wurden nach 24 stndiger Reaktionsdauer etwa 25 % der eingesetzten Indol-3-propionsure und 13 % des eingesetzten L ? Homotryptophans durch den FgaPT2 Ganzzellbiokatalysator umgesetzt. LC MS Untersuchungen besttigten die Identitt der entstandenen 4 Dimethylallyl Produkte. Der FgaPT2-Ganzzellbiokatalysator zeigte nach vierwchiger Lagerung bei 8 C keinen Aktivittsverlust. Bei Untersuchung der Wiederverwendbarkeit in drei wiederholten Reaktionszyklen lie sich auch mit diesem Ganzzellbiokatalysator unter den gewhlten Bedingungen eine Umsetzungsrate von 50 % whrend des letzten Reaktionszyklus verglichen mit dem Anfangswert detektieren.